2 × Pfu PCR Sib tov

A-1 Tus Qauv

Template Tus qauv muaj cov protein tsis zoo los yog Taq inhibitors, thiab lwm yam —— Kho cov qauv DNA kom huv, tshem cov protein tsis huv lossis rho tawm cov qauv DNA nrog cov khoom siv ua kom huv.

■ Qhov tsis lees paub ntawm tus qauv tsis ua tiav - - Ua kom tsim nyog ua kom sov qhov denaturation thiab ua kom ntev lub sijhawm denaturation.

■ Template degradation —— Rov npaj tus qauv.

A-2 Tus Thawj Coj

■ Hmoov tsis zoo ntawm cov primers —— Rov ua dua tus txheej txheem.

■ Primer degradation ——Alquot cov qib siab ua kom zoo ua ntej ntim rau khaws cia. Zam ntau yam khov thiab ua kom sov lossis lub sijhawm ntev 4 ° C cryopreserved.

Design Kev tsim qauv tsis zoo ntawm cov primers (piv txwv li primer ntev tsis txaus, dimer tsim ntawm cov primers, thiab lwm yam) -Res txheej txheej txheej tshiab (zam kev tsim primer dimer thiab cov qauv thib ob)

A-3 mg mas²⁺siab

■ Mg os²⁺ cov ntsiab lus qis dhau —— Ua kom zoo ntxiv Mg²⁺ concentration: Ua kom zoo dua Mg²⁺ concentration los ntawm cov tshuaj tiv thaiv kab mob los ntawm 1 mM txog 3 mM nrog rau lub sijhawm 0.5 mM los txiav txim siab qhov pom zoo Mg²⁺ concentration rau txhua tus qauv thiab primer.

A-4 Kub kub

■ Qhov kub ua kom sov siab cuam tshuam rau kev khi ntawm primer thiab tus qauv. —— Txo qhov kub kom txias thiab ua kom zoo dua qub nrog qhov gradient ntawm 2 ° C.

A-5 ncua sijhawm

Time Lub sijhawm ncua luv luv —— Ua kom lub sijhawm txuas ntxiv.

Phenomena: Cov piv txwv tsis zoo kuj qhia txog cov phiaj sib law liag.

A-1 Kev sib kis ntawm PCR

■ Hla kev sib kis ntawm cov phiaj sib luag lossis cov khoom lag luam nthuav dav -— Ua zoo saib kom tsis txhob xa cov qauv uas muaj cov phiaj sib luag hauv cov qauv tsis zoo lossis ua rau lawv tawm ntawm lub raj centrifuge. Cov tshuaj reagents lossis cov cuab yeej siv yuav tsum tau autoclaved kom tshem tawm cov nucleic acids uas twb muaj lawm, thiab kev muaj kab mob sib kis yuav tsum raug txiav txim siab los ntawm kev sim tsis zoo.

■ Reagent paug ——Txhua cov tshuaj reagents thiab khaws cia ntawm qhov kub tsawg.

A-2 Thawjr

■ Mg os²⁺ cov ntsiab lus qis dhau —— Ua kom zoo ntxiv Mg²⁺ concentration: Ua kom zoo dua Mg²⁺ concentration los ntawm cov tshuaj tiv thaiv kab mob los ntawm 1 mM txog 3 mM nrog rau lub sijhawm 0.5 mM los txiav txim siab qhov pom zoo Mg²⁺ concentration rau txhua tus qauv thiab primer.

Design Kev tsim qauv tsis zoo, thiab lub hom phiaj ua ntu zus muaj homology nrog rau cov hom phiaj tsis sib xws. --- Re-design primers.

Phenomena: PCR kev sib txuas ua ke tsis sib xws nrog qhov xav tau me me, loj lossis me, lossis qee zaum ob qho tshwj xeeb ua kom muaj suab nrov thiab tsis tshwj xeeb tshwj xeeb ua haujlwm tau tshwm sim.

A-1 Tus Thawj Coj

■ Tsis zoo tshwj xeeb primer

--- Re-tsim primer.

Concentration Lub hauv paus ntsiab lus siab dhau - - Ua kom muaj qhov ntsuas kub tsis txaus thiab ua kom lub sijhawm tsis ua haujlwm ntev.

A-2 Mg²⁺ siab

■ The Mg²⁺ siab yog siab dhau —— Ua kom txo Mg2+ qhov ua tau zoo: Ua kom zoo dua Mg²⁺ concentration los ntawm cov tshuaj tiv thaiv kab mob los ntawm 1 mM txog 3 mM nrog rau lub sijhawm 0.5 mM los txiav txim siab qhov pom zoo Mg²⁺ concentration rau txhua tus qauv thiab primer.

A-3 Thermostable polymerase

Enzy Cov enzyme ntau npaum li cas —— Txo cov enzyme kom tsim nyog thaum sib nrug ntawm 0.5 U.

A-4 Kub kub

Temperature Qhov ntsuas qhov kub qis dhau--Ua kom tsim nyog kom sov qhov kub kom sov lossis txais yuav ob txoj hauv kev ua kom sov

A-5 PCR mus

Many Muaj ntau lub PCR mus los —— Txo cov naj npawb ntawm PCR mus.

A-1 Tus Thawj Coj—— Qhov tshwj xeeb tsis zoo —— Rov tsim tus primer, hloov txoj haujlwm thiab ntev ntawm tus primer los txhim kho nws qhov tshwj xeeb; lossis ua zes PCR.

A-2 Template DNA

—— Tus qauv tsis dawb huv —— Ua kom huv cov qauv lossis rho tawm DNA nrog cov khoom siv ua kom huv.

A-3 mg mas²⁺ siab

—— Mg²⁺ siab yog siab dhau —— Txo txo ​​Mg²⁺ concentration: Ua kom zoo dua Mg²⁺ concentration los ntawm cov tshuaj tiv thaiv kab mob los ntawm 1 mM txog 3 mM nrog rau lub sijhawm 0.5 mM los txiav txim siab qhov pom zoo Mg²⁺ concentration rau txhua tus qauv thiab primer.

A-4 dNTP

——Qhov siab ntawm dNTPs siab dhau lawm —— Txo cov concentration ntawm dNTP kom tsim nyog

A-5 Kub kub

——Tau qhov kub kom txias tsawg heev —— Tsim nyog ua kom kub kom sov

A-6 Cycles

——Tej ntau txoj kev mus —— Ua kom zoo dua tus lej naj npawb

Thawj kauj ruam yog xaiv qhov tsim nyog polymerase. Taq polymerase tsis tu ncua tsis tuaj yeem txheeb xyuas tau vim tsis muaj 3'-5 'kev ua haujlwm tshwj xeeb, thiab kev tsis sib xws yuav txo qis kev ua haujlwm txuas ntxiv ntawm cov tawg. Yog li ntawd, Taq polymerase tsis tu ncua tsis tuaj yeem ua kom lub hom phiaj tawg ua haujlwm loj dua 5 kb. Taq polymerase nrog kev hloov kho tshwj xeeb lossis lwm yam kev ntseeg siab polymerase yuav tsum raug xaiv los txhim kho kev ua haujlwm txuas ntxiv thiab ua tau raws li qhov xav tau ntawm kev faib ua ntu ntu ntev. Ib qho ntxiv, kev nthuav dav ntawm cov ntu ntev kuj tseem xav tau kev hloov pauv ntawm cov qauv tsim ua ntej, lub sijhawm tsis sib xws, ncua sijhawm ntxiv, tsis pH, thiab lwm yam. Txhawm rau tiv thaiv tus qauv puas, lub sij hawm denaturation ntawm 94 ° C yuav tsum tau txo kom 30 sec los yog tsawg dua ib lub voj voog, thiab lub sijhawm kom kub kom txog 94 ° C ua ntej amplification yuav tsum tsawg dua 1 min. Ntxiv mus, teeb tsa qhov ntsuas kub ntxiv txog li 68 ° C thiab tsim lub sijhawm txuas ntxiv raws li tus nqi ntawm 1 kb/min tuaj yeem ua kom muaj txiaj ntsig zoo ntawm qhov tawg ntev.

Qhov ua yuam kev ntawm PCR kev nthuav dav tuaj yeem txo qis los ntawm kev siv ntau yam DNA polymerases nrog kev ncaj ncees siab. Ntawm tag nrho Taq DNA polymerases pom txog tam sim no, Pfu enzyme muaj qhov yuam kev qis tshaj thiab ua siab ncaj tshaj plaws (saib cov lus txuas nrog). Ntxiv nrog rau kev xaiv cov enzyme, cov kws tshawb fawb tuaj yeem txo qis PCR kev hloov pauv los ntawm kev ua kom zoo dua cov xwm txheej, suav nrog kev ua kom tsis muaj qhov tsis sib xws, kev ntsuas cov ntsuas cua sov polymerase thiab ua kom zoo dua PCR cov lej.