Ntshav ncaj qha PCR Cov Khoom
Nta
■ Yooj yim thiab nrawm: PCR kev nthuav dav tuaj yeem ua ncaj qha siv cov ntshav ua qauv, tsis tas yuav xav tau cov kauj ruam nyuaj ntawm kev npaj qauv thiab DNA rho tawm.
Pur Siab dawb huv: Kev hla ntawm cov qauv ua ntej kho thiab cov theem DNA rho tawm tuaj yeem pab kom zam kev hla kev sib kis ntawm cov qauv.
Through Siab dhau los: Kev txheeb xyuas PCR rau cov qauv loj tuaj yeem ua los ntawm kev sib txuas cov khoom siv nrog 96/384-zoo PCR daim hlau.
■ Muaj zog thoob ntiaj teb: Cov khoom siv no tuaj yeem ua kom muaj txiaj ntsig zoo GC tawg lossis tawg nrog cov qauv txheej txheem theem ob, thiab qhov ntev ntxiv tuaj yeem nce txog 5 kb.
Resistance Muaj zog tiv taus kev nyuaj siab: Cov khoom siv no tuaj yeem siv rau ntau hom thiab kuaj ntshav khaws cia hauv ntau txoj kev.
Cov ntawv thov
PCR cov khoom ntawm cov khoom siv no muaj "A" ntawm 3′-kawg, uas tuaj yeem siv ncaj qha rau TA vector cloning. Cov khoom siv no tuaj yeem siv rau kev nthuav dav ntawm cov noob caj noob ces DNA tawg, cov txiaj ntsig siab dhau ntawm kev tshuaj ntsuam genetic thiab genotyping (xws li kev txheeb xyuas noob) kev tshuaj xyuas.
Txhua yam khoom tuaj yeem tsim kho rau ODM/OEM. Yog xav paub ntxiv,thov nyem Customized Service (ODM/OEM)
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Siv tib neeg EDTA anticoagulation ua tus qauv, 4 lub noob nrog cov ntsiab lus sib txawv ntawm GC tau nthuav dav los ntawm Cov Ntshav Ntshav PCR Kit. PCR cov tshuaj tiv thaiv kab mob yog 20 μl, thiab 1 μl ntshav tau siv ua qauv. M: TIANGEN Marker II; 1: Fragment loj 1090 bp, GC cov ntsiab lus 68.1%; 2: Tshooj me me 1915 bp, GC cov ntsiab lus 70.4%; 3: Fragment size 448 bp, GC cov ntsiab lus 74.8%; 4: Ntim me me 1527 bp, GC cov ntsiab lus 61.5%. Cov txiaj ntsig sim: Ntshav Ncaj Ncaj PCR Kit tuaj yeem ua kom muaj txiaj ntsig DNA tawg nrog GC cov ntsiab lus ntawm thaj tsam ntawm 61.5%-74.8%, qhia tias nws muaj peev xwm ua kom nrov dua GC tawg. |
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Siv tib neeg EDTA anticoagulation ua tus qauv, 5 lub noob nrog qhov sib txawv qhov ntev (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 thiab Hn4.0) tau nthuav dav los ntawm Cov Khoom Ntshav PCR ncaj qha. PCR cov tshuaj tiv thaiv kab mob yog 20 μl, thiab 1 μl ntshav tau siv ua qauv. M: TIANGEN Marker II; 1-3: 3 cov ntshav sib txawv; NTC: tswj tsis muaj primers. Cov txiaj ntsig sim: Ntshav Ncaj Ncaj PCR Cov Khoom tuaj yeem nthuav tawm cov khoom tawg nrog qhov ntev li ntev li 4 kb, qhia tias nws muaj peev xwm nthuav tawm cov tawg ntev. |
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Siv tib neeg EDTA anticoagulation ua qauv, Ntshav Ntshav PCR Cov Khoom Siv tau siv rau PCR kuaj pom cov ntshav sib txawv. PCR cov tshuaj tiv thaiv kab mob yog 20 μl, thiab 1 μl ntshav tau siv ua qauv. M: TIANGEN Marker II; 1-9: qhov ntim cov ntshav yog 0.1 μl, 0.2 μl, 0.3 μl, 0.4 μl, 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl thiab 5 μl, feem; NTC: tswj tsis muaj tus qauv Cov txiaj ntsig sim: Ntshav Ncaj Ncaj PCR Kit muaj zog tiv taus cov ntshav thiab tuaj yeem ua kom cov ntshav kuaj nrog qhov ntim ntau ntawm 0.1-5 μl. |
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Kev kuaj ntshav los ntawm tib neeg, nas, nqaij qaib thiab lwm yam tsiaj nrog kev kho mob sib txawv tau siv ua qauv. Ntshav Ncaj Ncaj PCR Cov Khoom Siv tau siv los txhawb PRNP (tib neeg, 750 bp), Actin (nas, 200 bp), thiab β-Actin (Qaib, 1.0 kb). PCR cov tshuaj tiv thaiv kab mob yog 20 μl, thiab 1 μl ntshav tau siv ua qauv. M: TIANGEN Marker II. Cov txiaj ntsig sim: Ntshav Ncaj Ncaj PCR Cov Khoom tuaj yeem siv rau ntau qhov kev kuaj, thiab kev kuaj PCR ncaj qha tuaj yeem ua rau cov ntshav kuaj los ntawm ntau hom tsiaj nrog kev kho mob sib txawv. |
A-1 Tus Qauv
Template Tus qauv muaj cov protein tsis zoo los yog Taq inhibitors, thiab lwm yam —— Kho cov qauv DNA kom huv, tshem cov protein tsis huv lossis rho tawm cov qauv DNA nrog cov khoom siv ua kom huv.
■ Qhov tsis lees paub ntawm tus qauv tsis ua tiav - - Ua kom tsim nyog ua kom sov qhov denaturation thiab ua kom ntev lub sijhawm denaturation.
■ Template degradation —— Rov npaj tus qauv.
A-2 Tus Thawj Coj
■ Hmoov tsis zoo ntawm cov primers —— Rov ua dua tus txheej txheem.
■ Primer degradation ——Alquot cov qib siab ua kom zoo ua ntej ntim rau khaws cia. Zam ntau yam khov thiab ua kom sov lossis lub sijhawm ntev 4 ° C cryopreserved.
Design Kev tsim qauv tsis zoo ntawm cov primers (piv txwv li primer ntev tsis txaus, dimer tsim ntawm cov primers, thiab lwm yam) -Res txheej txheej txheej tshiab (zam kev tsim primer dimer thiab cov qauv thib ob)
A-3 mg mas2+siab
■ Mg os2+ cov ntsiab lus qis dhau —— Ua kom zoo ntxiv Mg2+ concentration: Ua kom zoo dua Mg2+ concentration los ntawm cov tshuaj tiv thaiv kab mob los ntawm 1 mM txog 3 mM nrog rau lub sijhawm 0.5 mM los txiav txim siab qhov pom zoo Mg2+ concentration rau txhua tus qauv thiab primer.
A-4 Kub kub
■ Qhov kub ua kom sov siab cuam tshuam rau kev khi ntawm primer thiab tus qauv. —— Txo qhov kub kom txias thiab ua kom zoo dua qub nrog qhov gradient ntawm 2 ° C.
A-5 ncua sijhawm
Time Lub sijhawm ncua luv luv —— Ua kom lub sijhawm txuas ntxiv.
Phenomena: Cov piv txwv tsis zoo kuj qhia txog cov phiaj sib law liag.
A-1 Kev sib kis ntawm PCR
■ Hla kev sib kis ntawm cov phiaj sib luag lossis cov khoom lag luam nthuav dav -— Ua zoo saib kom tsis txhob xa cov qauv uas muaj cov phiaj sib luag hauv cov qauv tsis zoo lossis ua rau lawv tawm ntawm lub raj centrifuge. Cov tshuaj reagents lossis cov cuab yeej siv yuav tsum tau autoclaved kom tshem tawm cov nucleic acids uas twb muaj lawm, thiab kev muaj kab mob sib kis yuav tsum raug txiav txim siab los ntawm kev sim tsis zoo.
■ Reagent paug ——Txhua cov tshuaj reagents thiab khaws cia ntawm qhov kub tsawg.
A-2 Thawjr
■ Mg os2+ cov ntsiab lus qis dhau —— Ua kom zoo ntxiv Mg2+ concentration: Ua kom zoo dua Mg2+ concentration los ntawm cov tshuaj tiv thaiv kab mob los ntawm 1 mM txog 3 mM nrog rau lub sijhawm 0.5 mM los txiav txim siab qhov pom zoo Mg2+ concentration rau txhua tus qauv thiab primer.
Design Kev tsim qauv tsis zoo, thiab lub hom phiaj ua ntu zus muaj homology nrog rau cov hom phiaj tsis sib xws. --- Re-design primers.
Phenomena: PCR kev sib txuas ua ke tsis sib xws nrog qhov xav tau me me, loj lossis me, lossis qee zaum ob qho tshwj xeeb ua kom muaj suab nrov thiab tsis tshwj xeeb tshwj xeeb ua haujlwm tau tshwm sim.
A-1 Tus Thawj Coj
■ Tsis zoo tshwj xeeb primer
--- Re-tsim primer.
Concentration Lub hauv paus ntsiab lus siab dhau - - Ua kom muaj qhov ntsuas kub tsis txaus thiab ua kom lub sijhawm tsis ua haujlwm ntev.
A-2 Mg2+ siab
■ The Mg2+ siab yog siab dhau —— Ua kom txo Mg2+ qhov ua tau zoo: Ua kom zoo dua Mg2+ concentration los ntawm cov tshuaj tiv thaiv kab mob los ntawm 1 mM txog 3 mM nrog rau lub sijhawm 0.5 mM los txiav txim siab qhov pom zoo Mg2+ concentration rau txhua tus qauv thiab primer.
A-3 Thermostable polymerase
Enzy Cov enzyme ntau npaum li cas —— Txo cov enzyme kom tsim nyog thaum sib nrug ntawm 0.5 U.
A-4 Kub kub
Temperature Qhov ntsuas qhov kub qis dhau--Ua kom tsim nyog kom sov qhov kub kom sov lossis txais yuav ob txoj hauv kev ua kom sov
A-5 PCR mus
Many Muaj ntau lub PCR mus los —— Txo cov naj npawb ntawm PCR mus.
A-1 Tus Thawj Coj—— Qhov tshwj xeeb tsis zoo —— Rov tsim tus primer, hloov txoj haujlwm thiab ntev ntawm tus primer los txhim kho nws qhov tshwj xeeb; lossis ua zes PCR.
A-2 Template DNA
—— Tus qauv tsis dawb huv —— Ua kom huv cov qauv lossis rho tawm DNA nrog cov khoom siv ua kom huv.
A-3 mg mas2+ siab
—— Mg2+ siab yog siab dhau —— Txo txo Mg2+ concentration: Ua kom zoo dua Mg2+ concentration los ntawm cov tshuaj tiv thaiv kab mob los ntawm 1 mM txog 3 mM nrog rau lub sijhawm 0.5 mM los txiav txim siab qhov pom zoo Mg2+ concentration rau txhua tus qauv thiab primer.
A-4 dNTP
——Qhov siab ntawm dNTPs siab dhau lawm —— Txo cov concentration ntawm dNTP kom tsim nyog
A-5 Kub kub
——Tau qhov kub kom txias tsawg heev —— Tsim nyog kom ua kom sov sov
A-6 Cycles
——Tej ntau txoj kev mus —— Ua kom zoo dua tus lej naj npawb
Thawj kauj ruam yog xaiv qhov tsim nyog polymerase. Taq polymerase tsis tu ncua tsis tuaj yeem txheeb xyuas tau vim tsis muaj 3'-5 'kev ua haujlwm tshwj xeeb, thiab kev tsis sib xws yuav txo qis kev ua haujlwm txuas ntxiv ntawm cov tawg. Yog li ntawd, Taq polymerase tsis tu ncua tsis tuaj yeem ua kom lub hom phiaj tawg ua haujlwm loj dua 5 kb. Taq polymerase nrog kev hloov kho tshwj xeeb lossis lwm yam kev ntseeg siab polymerase yuav tsum raug xaiv los txhim kho kev ua haujlwm txuas ntxiv thiab ua tau raws li qhov xav tau ntawm kev faib ua ntu ntu ntev. Ib qho ntxiv, kev nthuav dav ntawm cov ntu ntev kuj tseem xav tau kev hloov pauv ntawm cov qauv tsim ua ntej, lub sijhawm tsis sib xws, ncua sijhawm ntxiv, tsis pH, thiab lwm yam. Txhawm rau tiv thaiv tus qauv puas, lub sij hawm denaturation ntawm 94 ° C yuav tsum tau txo kom 30 sec los yog tsawg dua ib lub voj voog, thiab lub sijhawm kom kub kom txog 94 ° C ua ntej amplification yuav tsum tsawg dua 1 min. Ntxiv mus, teeb tsa qhov ntsuas kub ntxiv txog li 68 ° C thiab tsim lub sijhawm txuas ntxiv raws li tus nqi ntawm 1 kb/min tuaj yeem ua kom muaj txiaj ntsig zoo ntawm qhov tawg ntev.
Qhov ua yuam kev ntawm PCR kev nthuav dav tuaj yeem txo qis los ntawm kev siv ntau yam DNA polymerases nrog kev ncaj ncees siab. Ntawm tag nrho Taq DNA polymerases pom txog tam sim no, Pfu enzyme muaj qhov yuam kev qis tshaj thiab ua siab ncaj tshaj plaws (saib cov lus txuas nrog). Ntxiv nrog rau kev xaiv cov enzyme, cov kws tshawb fawb tuaj yeem txo qis PCR kev hloov pauv los ntawm kev ua kom zoo dua cov xwm txheej, suav nrog kev ua kom tsis muaj qhov tsis sib xws, kev ntsuas cov ntsuas cua sov polymerase thiab ua kom zoo dua PCR cov lej.
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Txij li nws tau tsim, peb lub Hoobkas tau tsim thawj cov khoom lag luam hauv ntiaj teb nrog ua raws txoj cai
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